尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网

生物实验室耗材厂商中国智造 中国创造 辐射全球

服务热线400-000-9961
尊龙凯时医疗产品通过ISO13485质量体系认证及欧盟CE认证

针对初学者: 关于实时定量PCR的16个专业术语和常见问题

来源: | 发布日期:2022-12-16 | 浏览量:1

当您刚毕业并进入工作时,与一堆名词面对的实时定量PCR实验接触,您是否对从哪里开始感到困惑? 放大曲线,标准曲线,阈值,CT值,熔解曲线和基线的含义是什么? 那些实验的荧光图像太亮了,但我似乎无法识别它们。 今天,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网将带您分两个部分学习这些知识和概念:专业术语和常见问题。


第一部分专业条款

1.扩增曲线

放大曲线是指曲线,其中循环数为横坐标和反应期间的实时荧光强度为PCR过程中的纵坐标。

2.基线

基线指的是,在PCR扩增反应的前几个周期中,荧光信号几乎没有变化。 信号级别显示接近直线,这种直线是基线。

3.荧光阈值设置

 通常,PCR反应的前15个周期的荧光信号用作荧光背景信号,荧光阈值是PCR 3-15个周期期间荧光信号的标准偏差的10倍,并设置了荧光阈值 在PCR扩增的指数阶段。 通常,每个仪器在使用前都有其荧光阈值。

4. CT值

CT值表示当荧光信号达到设定阈值时,每个PCR反应管都会发生的循环数。 从研究中,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网知道每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数之间存在线性关系。 初始副本编号越多,CT值越小,反之亦然。 使用具有已知起始副本编号的标准,可以制作校准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,而纵坐标表示CT值。 因此,只要获得未知样品的CT值,就可以从标准曲线中计算样品的初始拷贝数。

知道更多

有几个指标可以判断放大曲线是否良好:

答:曲线的拐点很明显,尤其是低重分样品的指数相很明显,放大曲线的总体平行性很好,基线是平坦的,没有上升现象,并且低 - 级的指数相位 浓度样品放大曲线很明显。

B:曲线指数相的斜率与扩增效率成正比,斜率越大,放大效率越高。

C:标准的基线是平坦或略微降低的,没有明显的向上趋势。

D:每个管的扩增曲线的并行性很好,表明每个反应管的扩增效率相似。

5.熔化曲线
当PCR产物加热时,随着温度的升高,双链扩增产物逐渐解离,从而导致荧光强度降低。 当达到一定温度时,大量产品分离,导致荧光急剧降低。 使用此功能以及不同PCR产物的不同TM值使荧光信号迅速下降的温度也不同,这可能是识别PCR特异性的好方法。
6.熔化曲线(采用对数曲线)
以熔解曲线的对数形成峰值图,以更直观地显示产品片段的情况。 由于熔化温度是DNA片段的TM值,因此可以确定某些影响DNA片段TM值的参数,例如片段大小,GC含量等。通常,根据尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网的底漆设计原理,通常会说 放大产物的长度在80-300bp的范围内,熔化温度应在80°C和90°C之间。
答:如果在80°C和90°C之间只有一个主峰,则意味着荧光定量PCR是完美的。
B:如果主峰出现在80°C和90°C之间,并且杂质峰出现在80°C以下,则基本上考虑了引物二聚体。 这是一个不错的选择,试图提高退火温度解决。
C:如果主峰出现在80°C和90°C之间,并且当温度升高时出现流浪峰,则基本上考虑了DNA污染。 并且需要在实验的初始阶段去除DNA。
7.标准曲线线
将标准标准稀释至不同的浓度,并用作PCR反应的模板。 标准曲线以标准拷贝数的对数为横坐标,将测量的CT值作为纵坐标绘制。 量化未知样品时,可以根据未知样品的CT值从标准曲线获得样品的拷贝数。 标准曲线对于绝对定量非常重要。

第二部分。 常见问题

Q1:RT-PCR,QPCR,实时PCR和实时RT-PCR有什么区别?

A1:RT-PCR是逆转录PCR,它是聚合酶链反应的广泛使用的变体。 在RT-PCR中,将RNA链反转录为互补DNA,然后用作PCR通过PCR扩增DNA的模板。

实时PCR和QPCR是同一件事,两者都是实时定量PCR,这意味着PCR过程中的每个周期都有数据的实时记录。 这样,可以精确分析启动模板的数量。

尽管实时PCR和逆转录PCR似乎都可以缩写为RT-PCR,但国际公约是RT-PCR专门指的是逆转录PCR,而实时PCR通常被缩写为qPCR(量化实际真实的真实真实真实的真实PCR)  - 时间PCR)。

实时RT-PCR(RT-QPCR)是一种逆转录PCR,结合了荧光定量技术:从RNA到获得cDNA(RT)的首次逆转录,然后使用实时PCR进行定量分析(QPCR)。

Q2:为什么在80-300bp的范围内控制荧光定量PCR的放大产物片段的长度?

A2:每个基因序列的长度不同,其中一些是几个Kb和几百个BP。 但是,当尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网设计底漆时,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网只需要要求产品的长度为80-300bp,而太短或太长不适合定量PCR检测。

产品片段太短,无法与引物二聚体区分开。 引物二聚体的长度约为30-40bp,当它小于80bp时,很难区分它是引物二聚体还是产品。 如果产品片段太长,超过300bp,这很容易导致放大效率较低,并且无法有效检测基因的量。

例如,当您计算教室里的人数时,您只需要计算有多少个嘴巴即可。 检测基因时也是如此。 您只需要检测一个基因的某个序列即可表示整个序列。 如果您既计算嘴巴的数量,又要计算鼻子,耳朵和眼镜的数量以计算人数,那么犯错很容易。

Q3:底漆设计的最佳长度是多少?

A3:一般而言,20-24bp范围内的底漆长度很好。 当然,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网必须在设计底漆时注意底漆TM值,因为它与最佳退火温度有关。 经过大量实验,已经证明60℃是一个很好的TM值。 低退火温度很容易导致非特异性扩增,而高退火温度通常会导致放大效率低,放大曲线的晚期峰和延迟的CT值。

问题4:收集的样品量会影响实验结果吗?

A4:不。显然,收集的样品越多,提取的RNA越多,cDNA越多,目标片段就会越多。 对于绝对定量,要计算目标片段的拷贝数,收集的样品量肯定会影响实验结果。 例如,检测血液中丙型肝炎病毒HBV的是以一定量(1ml)的血液检测HBV含量。

对于科学研究中通常使用的相对定量,样品的数量与实验结果无关,因为相对定量是指靶基因与参考基因之间的比较。 只是请认为它们是同一核酸链中存在的上游和下游片段。 如果样本量很大,则参考基因和靶基因均以同等比例同时增加,这不会影响结果。

Q5:逆转录酶的效率会影响实验结果吗?

A5:与上面相同。 请注意,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网希望获得更高的逆转录效率,但是尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网更渴望逆转录酶的逆转录效率相对稳定并获得均匀的结果。 这将是对主要公司逆转录套件的优化功能的测试。

问题6:TAQ酶的效率会影响实验结果吗?

A6:TAQ酶的效率相对较大。 通常,需要热启动的taq酶,并且效率相对较高。 对于商业荧光定量试剂盒,每个制造商将根据自己的产品接近100%的产品来优化最佳状态的效率,如果效率太低,则无法获得实验结果。 对于不同公司的产品,这是质量的衡量标准。

问题7:荧光染料的量会影响实验结果吗?

A7:是的,会。 如果荧光染料太饱和,则会引起某些仪器的噪声干扰。 如果荧光染料未饱和,并且荧光值太低,则它将尽早进入高原相,并且放大曲线将是平坦的。 在荧光定量实验中,主要看到CT值,因此对于晚期扩增曲线而言,进入高原阶段并不重要,但是该图不够美丽。 如果您必须做出选择,则首先选择荧光染料稍微不饱和。 但是,当使用同一公司的同一产品时,其效果基本上可以忽略不计。

问题8:PCR管的透射会影响实验结果吗?

A8:是的。 但是,对于来自同一制造商的同一批消耗品,可以忽略这种效果。 这是一个不错的选择,最好使用带有高渗透性膜的96孔板来最大程度地减少消耗品的光透射率的影响。

Q9:操作期间的误差会影响实验结果吗?

A9:操作过程的影响主要反映在均匀性中。 均匀性意味着系统中的所有组件均匀混合在一起,瞬时离心可以解决此问题。 此外,对于初学者,最好将PCR系统调整为20英寸以上,而一个太小的系统更容易出现错误。 如果正确优化退火温度,则底漆浓度对CT的影响最小化。 而且您会知道,可以通过优化退火温度来避免一些操作错误(例如底漆浓度)。

总结

以上是新手在实验期间经常遇到的一些问题和疑问,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网希望这些问题可以帮助您解决一些困惑。 实验是产生混乱和解决问题的过程,希望您能从中得到一些东西。 感谢您的阅读,尊龙凯时(中国)人生就是搏! 官网下次会见您!